Ep 20 — Introducción al análisis cuantitativo: Ley de Lambert-Beer

Serie: Enciclopedia de espectroscopia IR: de los principios a la práctica
Capítulo: Segunda parte · Nivel principiante — Entrando al laboratorio
Público: Estudiantes de secundaria/universidad, posgrado, técnicos de laboratorio que recién comienzan
Conocimiento previo: Ep 04 (Cómo leer un espectro IR), Ep 16 (Preparación de muestras), Ep 17 (Operación del instrumento), Ep 18 (Procesamiento de espectros), Ep 19 (Análisis cualitativo)
Tiempo de lectura: Aproximadamente 40 minutos

Introducción: Del "qué es" al "cuánto"

En 1760, el matemático alemán Johann Heinrich Lambert escribió en un libro de óptica una proposición aparentemente simple: La atenuación de la luz al pasar a través de un medio está relacionada exponencialmente con el espesor del medio [1][2].

En 1852, el físico alemán August Beer extendió esta ley a las soluciones: la atenuación también es proporcional a la concentración [1][2]. Esta es la fórmula conocida como la "Ley de Lambert-Beer":

$$A = \varepsilon \cdot b \cdot c$$

Una fórmula breve que establece la relación cuantitativa entre la absorbancia $A$, la longitud del camino $b$ y la concentración $c$, convirtiéndose en la base de todo el análisis cuantitativo espectroscópico moderno — UV-Vis, IR, fluorescencia dependen de ella [1][3].

Para la espectroscopia infrarroja, el valor de la Ley de Lambert-Beer radica en: conociendo la absorbancia de un pico característico de un grupo funcional, se puede deducir la concentración. Esto significa que podemos usar la espectroscopia IR para analizar cuantitativamente los componentes de una mezcla, monitorear el progreso de reacciones, controlar la calidad del producto — sin necesidad de separación [1][4].

En este episodio, explicaremos sistemáticamente: derivación y condiciones de aplicabilidad de la Ley de Lambert-Beer, método de altura de pico vs. área de pico, método de curva de calibración, cuantificación multicomponente, precauciones, comparación con UV-Vis/cromatografía, y un ejemplo completo que demuestra el proceso de análisis cuantitativo.

💡 Enfoque de este episodio: Ep 19 fue cualitativo ("qué es"), este episodio es cuantitativo ("cuánto"). Ambos juntos constituyen la capacidad central del análisis por espectroscopia IR. Este episodio también es el cierre de la segunda parte "Nivel principiante".

I. Ley de Lambert-Beer

1.1 Derivación de la ley

Considere un haz de luz monocromática con intensidad $I_0$ que pasa a través de una solución de espesor $b$ y concentración $c$, resultando en una intensidad $I$ [1][3]:

        I₀ → ────────────────────→ I
              ┌────────────────┐
              │  Solución (trayecto b) │
              │  Concentración c       │
              └────────────────┘

Paso 1: Ley de Lambert (Lambert, 1760) [1][2]

La atenuación al pasar a través de una capa delgada $db$:

$$\frac{dI}{I} = -\alpha \, db$$

Integrando:

$$\ln\frac{I_0}{I} = \alpha \cdot b$$

Convirtiendo a logaritmo común:

$$\log\frac{I_0}{I} = \frac{\alpha}{2.303} \cdot b = K \cdot b$$

donde $K$ es una constante relacionada con las propiedades del medio.

Paso 2: Ley de Beer (Beer, 1852) [1][2]

$K$ es proporcional a la concentración $c$:

$$K = \varepsilon \cdot c$$

Sustituyendo se obtiene la Ley de Lambert-Beer:

$$\boxed{A = \log\frac{I_0}{I} = \varepsilon \cdot b \cdot c}$$

donde [1][3]:

• $A$: absorbancia (adimensional, a menudo expresada como Abs)
• $\varepsilon$: coeficiente de absortividad molar (L·mol⁻¹·cm⁻¹)
• $b$: longitud del camino (cm)
• $c$: concentración (mol/L)

1.2 Transmitancia y absorbancia

Transmitancia [1][3]:

$$T = \frac{I}{I_0}$$

Porcentaje de transmitancia: %T = $T \times 100\%$

Absorbancia:

$$A = -\log T = \log\frac{I_0}{I} = -\log\left(\frac{I}{I_0}\right)$$

Relación entre T y A:

Tabla 1: Conversión entre transmitancia y absorbancia (compilado de [1][3])

Rango óptimo de absorbancia [1][3][4]:

• 0.3–1.0 (ideal)
• 0.1–1.5 (aceptable)
• < 0.1: mucho ruido

• 1.5: posible desviación de la linealidad

1.3 Coeficiente de absortividad molar $\varepsilon$

Significado físico [1][3]: absorbancia a concentración unitaria (1 mol/L) y longitud de camino unitaria (1 cm).

IR vs UV-Vis [1][4][5]:

Tabla 2: Comparación de coeficientes de absortividad molar entre UV-Vis e IR (compilado de [1][5])

Punto clave [1][5]: El $\varepsilon$ en IR es 10–1000 veces menor que en UV-Vis, por lo que la cuantificación por IR requiere longitudes de camino más largas o concentraciones más altas.

1.4 Condiciones de aplicabilidad

La Ley de Lambert-Beer no es universal y debe cumplir las siguientes condiciones [1][3][4]:

① Luz monocromática

• FTIR obtiene "luz monocromática virtual" mediante la transformada de Fourier del interferograma, teóricamente cumple
• Pero una resolución insuficiente puede causar desviaciones

② Solución diluida

• A altas concentraciones (> 0.01 mol/L), las interacciones intermoleculares (enlaces de hidrógeno, agregación) cambian $\varepsilon$
• En IR a menudo se usan líquidos puros o sólidos, concentraciones altas, se debe tener especial cuidado

③ Sin dispersión

• La luz dispersa no participa en la absorción pero aumenta el fondo
• Las pastillas de KBr deben molerse suficientemente (< 2 μm)

④ Sin fluorescencia ni reacciones fotoquímicas

• La energía IR es baja, generalmente no hay fluorescencia
• Pero algunas muestras fotosensibles requieren atención

⑤ Medio homogéneo

• La distribución de la muestra debe ser uniforme
• Las pastillas deben ser uniformes

⑥ Longitud de camino fija

• Las celdas de líquido de transmisión tienen una longitud de camino precisa
• La "longitud de camino" de las pastillas de KBr está determinada por el espesor, se necesita un estándar interno para compensar

1.5 Causas de desviación de la Ley de Lambert-Beer

Desviación química [1][3][4]:

• Cambios en el estado molecular debido a la concentración (p. ej., asociación por puentes de hidrógeno, disociación)
• Diferentes formas ácido-base a diferentes pH
• Diferentes disolventes cambian $\varepsilon$

Desviación instrumental [1][3][4]:

• Luz parásita (stray light)
• Respuesta no lineal del detector
• Resolución insuficiente
• Longitud de camino inexacta

Manifestación típica: La curva de calibración se curva en el extremo de alta concentración (hacia abajo o hacia arriba).

II. Método de altura de pico vs. método de área de pico

2.1 Método de altura de pico (Peak Height)

Método [1][3][4]: Mide la distancia vertical desde la cima del pico hasta la línea base.

Absorbancia
   ↑
1.0│            ▓▓
0.8│           ▓██▓          ← altura del pico = 0.8
0.6│          ▓████▓          
0.4│        ▓▓██████▓▓        
0.2│      ▓▓▓▓████████▓▓      
0.0│────▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓──→ ν
              ↑
            posición ν₀

Figura 1: Esquema del método de altura de pico

Ventajas [1][3]:

• Cálculo simple
• Poca influencia del ruido
• Buena reproducibilidad (poco sensible a la selección del punto de línea base)

Desventajas [1][3][4]:

• Afectado por el ancho del pico (si el pico se ensancha pero el área permanece igual, la altura disminuye)
• Afectado por el desplazamiento de la posición del pico
• Afectado por la resolución

2.2 Método del Área del Pico (Peak Area)

Método [1][3][4]: Integrar la absorbancia entre los "límites de integración" a ambos lados del pico.

$$\text{Área} = \int_{\nu_1}^{\nu_2} A(\nu) \, d\nu$$

Absorbancia
   ↑
1.0│            ▓▓
0.8│           ▓██▓          
0.6│          ▓████▓          ← Área sombreada = área del pico
0.4│        ▓▓██████▓▓        
0.2│      ▓▓▓▓████████▓▓      
0.0│────▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓▓──→ ν
        ↑                  ↑
        ν₁              ν₂
        ←── Intervalo de integración ──→

Figura 2: Esquema del método del área del pico

Ventajas [1][3][4]:

• Poco afectado por el ancho del pico
• Poco afectado por el desplazamiento de la posición del pico
• Poco afectado por la resolución
• Más adecuado para picos anchos en IR

Desventajas [1][3][4]:

• Muy afectado por la selección de puntos de la línea base
• Afectado por la superposición de picos vecinos
• Cálculo complejo

2.3 Recomendaciones de selección

Tabla 3: Altura del pico vs. Área del pico (compilado de [1][3][4])

💡 Consejo profesional: Normalmente se realizan ambos métodos (altura y área del pico) y se compara cuál tiene menor RSD, seleccionando el de menor RSD [3][4].

3. Método de la Curva de Calibración

El método de la curva de calibración (curva estándar, curva de calibración) es el método más utilizado en análisis cuantitativo [1][3][4].

3.1 Construcción de la curva de calibración

Procedimiento [1][3][4]:

1. Preparar 5–7 soluciones estándar de diferentes concentraciones (o pastillas de KBr)
2. Medir el espectro infrarrojo de cada estándar
3. Seleccionar el pico de análisis característico
4. Calcular la altura o el área del pico para cada estándar
5. Graficar la absorbancia (o área) frente a la concentración
6. Ajuste lineal, obteniendo la curva de calibración

Datos de ejemplo [3][4]:

Ajuste lineal [3][4]:

$$A = k \cdot c + a$$

donde $k$ es la pendiente (sensibilidad) y $a$ es la intersección (teóricamente = 0).

Área del pico A
   ↑
20│                                ●   ← 20 mg/mL
  │                            ●
15│
  │                        ●
10│
  │                    ●
 5│                ●
  │            ●
 0│───●─────────────────────────────→ c (mg/mL)
   0   5   10   15   20

Figura 3: Curva de calibración típica (rango lineal 0–20 mg/mL)

3.2 Indicadores de evaluación de la curva de calibración

Coeficiente de correlación lineal $R^2$ [1][3][4]:

• $R^2 > 0.999$: Excelente
• $R^2 = 0.99$–$0.999$: Bueno
• $R^2 = 0.95$–$0.99$: Aceptable (precisión limitada)
• $R^2 < 0.95$: Malo, rediseñar

Rango lineal [1][3][4]:

• Dentro de este rango, la relación entre $A$ y $c$ es lineal
• Puede desviarse en concentraciones altas (desviación química)
• Puede desviarse en concentraciones bajas debido a SNR deficiente

Límite de detección (LOD) [3][4]:

$$\text{LOD} = \frac{3\sigma}{k}$$

donde $\sigma$ es la desviación estándar del blanco y $k$ es la pendiente de la curva de calibración.

Límite de cuantificación (LOQ) [3][4]:

$$\text{LOQ} = \frac{10\sigma}{k}$$

3.3 Medición de muestras desconocidas

1. Medir el espectro de la muestra desconocida
2. Calcular la absorbancia (o área) del pico característico
3. Sustituir en la curva de calibración: $c = (A - a) / k$
4. Reportar la concentración

Ejemplo [3][4]:

• Área del pico de la muestra desconocida = 4.50
• Curva de calibración: $A = 0.825 \cdot c + 0.05$
• Concentración: $c = (4.50 - 0.05) / 0.825 = 5.39$ mg/mL

3.4 "Calidad" de la curva de calibración

Determinar si la curva de calibración es confiable [1][3][4]:

• $R^2 > 0.999$
• Intersección $a$ cercana a 0 (teóricamente)
• Residuos distribuidos aleatoriamente (sin tendencia sistemática)
• El rango lineal cubre la concentración de la muestra desconocida
• Al menos 3 réplicas por estándar

Problemas comunes [3][4]:

• Curvatura a altas concentraciones: diluir y repetir
• Desviación a bajas concentraciones: aumentar número de barridos, mejorar SNR
• Intersección alta: verificar blanco, sustraer fondo

4. Cuantificación con pastilla de KBr

La pastilla de KBr es el método más común para sólidos, pero con consideraciones especiales [1][3][4].

4.1 Problema del "camino óptico" en pastillas de KBr

El espesor de la pastilla de KBr es difícil de controlar con precisión debido a la presión, cantidad de muestra, y molienda [1][3][4].

Solución: Método del estándar interno

Estándares internos comunes [1][3][4]:

• KSCN: 2050 cm⁻¹ (estiramiento C≡N), sin superposición con la mayoría de picos orgánicos
• NaN₃: 2140 cm⁻¹ (estiramiento asimétrico N₃⁻)
• KNO₃: 1384 cm⁻¹ (estiramiento asimétrico NO₃⁻)

Principio de cuantificación con estándar interno [3][4]:

1. Agregar la misma cantidad de estándar interno (p. ej., 1% KSCN) a cada estándar y muestra desconocida
2. Medir el área del pico característico de la muestra $As$ y del estándar interno $A{\text{std}}$
3. Calcular la relación $R = As / A{\text{std}}$
4. Graficar $R$ frente a la concentración $c$ para obtener la curva de calibración

Ventajas [3][4]:

• Elimina errores de espesor de pastilla
• Elimina incertidumbre del camino óptico
• Mejora la reproducibilidad

4.2 Procedimiento de cuantificación con pastilla de KBr

Pasos [3][4]:

1. Preparar serie de estándares (5–7 concentraciones)
   │ Estándar + KBr + estándar interno KSCN
   │ Moler y mezclar homogéneamente
   │
   ▼
2. Prensar (3 réplicas por estándar)
   │
   ▼
3. Medir espectros
   │
   ▼
4. Medir pico de la muestra y pico del estándar interno
   │
   ▼
5. Calcular relación R = A_s / A_std
   │
   ▼
6. Graficar curva de calibración R vs c
   │
   ▼
7. Medir muestra desconocida
   │ Agregar misma cantidad de estándar interno
   │ Prensar, medir, calcular relación
   │
   ▼
8. Obtener concentración de la curva de calibración

Figura 4: Procedimiento de cuantificación con pastilla de KBr (referencia [3][4])

4.3 Precisión de la cuantificación con pastilla de KBr

RSD típico [3][4]:

• Sin estándar interno: 5–10%
• Con estándar interno: 1–3%
• Prensa automática: < 1%

5. Cuantificación con celda de líquidos

La celda de líquidos es el estándar de oro para muestras líquidas, con camino óptico controlable con precisión [1][3][4].

5.1 Medición del camino óptico de la celda

Método de franjas de interferencia [1][3][4]:

Medición de transmitancia de la celda vacía, obteniendo franjas de interferencia:

Transmitancia
   ↑
100│  ▓▓▓▓  ▓▓▓▓  ▓▓▓▓  ▓▓▓▓
   │      ▓▓      ▓▓      ▓▓
 0│────────────────────────────→ ν

Fórmula de la longitud de trayectoria óptica [1][3]:

$$b = \frac{1}{2 \cdot n \cdot \left(\frac{1}{\nu_2 - \nu_1}\right)} = \frac{\nu_2 - \nu_1}{2n \cdot N}$$

donde $n$ es el índice de refracción del medio dentro de la celda (aire $n=1$), $N$ es el número de franjas entre $\nu_1$ y $\nu_2$.

Ejemplo [3]:

• Hay 10 franjas entre 1000–2000 cm⁻¹
• $b = (2000-1000)/(2 \times 1 \times 10) = 50\,\mu\text{m} = 0.05\,\text{mm}$

5.2 Procedimiento de cuantificación con celda de líquido

Pasos [1][3][4]:

1. Seleccionar una celda de líquido con la longitud de trayectoria adecuada (evitar flat-top)
2. Medir la longitud de trayectoria real (método de franjas de interferencia)
3. Preparar una serie de estándares
4. Medir el espectro de cada estándar
5. Seleccionar picos característicos, calcular la absorbancia
6. Construir la curva de calibración $A$ vs $c$
7. Medir la muestra desconocida
8. Obtener la concentración de la curva de calibración

5.3 Precisión de la cuantificación con celda de líquido

RSD típico [3][4]:

• Celda fija: 0.5–1%
• Celda desmontable: 1–3%
• Celda de alta gama: < 0.5%

Seis. Cuantificación por ATR

Aunque la longitud de trayectoria del ATR varía con la longitud de onda, aún se puede cuantificar bajo condiciones fijas [3][4][7].

6.1 Viabilidad de la cuantificación por ATR

Requisitos previos [3][4][7]:

• Material del cristal y ángulo de incidencia fijos
• Cantidad de muestra y presión fijas
• Temperatura fija
• Usar relaciones de alturas de pico o áreas, no absorbancia absoluta

6.2 Procedimiento de cuantificación por ATR

Pasos [3][7]:

1. Preparar una serie de estándares
2. Medición por ATR (presión y cristal fijos)
3. Medir la absorbancia de los picos característicos
4. Construir la curva de calibración $A$ vs $c$
5. Medir la muestra desconocida

6.3 Precisión de la cuantificación por ATR

RSD típico [3][4][7]:

• ATR con presión manual: 2–5%
• ATR con presión neumática: 1–2%
• Similar a la cuantificación con celda de líquido

⚠️ Nota sobre cuantificación por ATR: Se debe adquirir un nuevo fondo antes de cada medición, ya que la temperatura y presión del cristal pueden afectar el fondo [3][7].

Siete. Cuantificación de múltiples componentes

7.1 Cuantificación de dos componentes

Principio [1][3][4]: Dos componentes tienen absorción en dos picos característicos, pero con diferentes proporciones.

Sean dos componentes A y B, con concentraciones $c_A, c_B$, y absorbancias en los números de onda $\nu_1, \nu_2$:

$$\begin{cases} A_{\nu_1} = \varepsilon_{A1} \cdot b \cdot c_A + \varepsilon_{B1} \cdot b \cdot c_B \\ A_{\nu_2} = \varepsilon_{A2} \cdot b \cdot c_A + \varepsilon_{B2} \cdot b \cdot c_B \end{cases}$$

Solución:

$$\begin{pmatrix} c_A \\ c_B \end{pmatrix} = \frac{1}{b} \begin{pmatrix} \varepsilon_{A1} & \varepsilon_{B1} \\ \varepsilon_{A2} & \varepsilon_{B2} \end{pmatrix}^{-1} \begin{pmatrix} A_{\nu_1} \\ A_{\nu_2} \end{pmatrix}$$

Ejemplo [3][4]: Determinación de una mezcla de acetato de etilo + ácido acético

• C=O de acetato de etilo: 1740 cm⁻¹
• C=O de ácido acético: 1710 cm⁻¹
• Medir la absorbancia en los números de onda 1740 y 1710
• Resolver las ecuaciones simultáneas para obtener $c_A, c_B$

7.2 Cuantificación de múltiples componentes (≥ 3)

Método matricial [1][3][4]:

$$\mathbf{A} = \mathbf{E} \cdot \mathbf{C} \cdot b$$

Donde:

• $\mathbf{A}$: vector de absorbancias (en varios números de onda)
• $\mathbf{E}$: matriz de coeficientes de absortividad
• $\mathbf{C}$: vector de concentraciones

Inversión:

$$\mathbf{C} = \frac{1}{b} \mathbf{E}^{-1} \mathbf{A}$$

Condiciones [3][4]:

• Matriz no singular (determinante ≠ 0)
• Los espectros de cada componente son diferentes
• Números de onda medidos ≥ número de componentes

7.3 PLS (Mínimos Cuadrados Parciales)

Principio [3][4][8]: Utilizar datos de espectro completo para construir un modelo lineal, evitando la subjetividad en la selección de picos.

Procedimiento [3][8]:

1. Preparar una gran cantidad de muestras conocidas (≥ 30, que cubran el rango de concentraciones)
2. Medir el espectro completo (4000–400 cm⁻¹)
3. Construir el modelo de calibración usando el algoritmo PLS
4. Validar el modelo (usando un conjunto de validación)
5. Medir la muestra desconocida y predecir la concentración

Ventajas [3][8]:

• Utiliza información del espectro completo, mayor precisión
• Maneja picos superpuestos
• Adecuado para mezclas complejas

Desventajas [3][8]:

• Requiere muchas muestras de calibración
• Requiere software especializado (PLS Toolbox, Unscrambler)
• Costo de mantenimiento del modelo

Software [3][8]:

• Thermo TQ Analyst
• Bruker OPUS QUANT
• PLS_Toolbox (MATLAB)
• Python (scikit-learn, pyMCR)

Ocho. Consideraciones para el análisis cuantitativo

8.1 Consistencia de la longitud de trayectoria

Celda de transmisión [1][3][4]:

• Medir todas las muestras con la misma celda
• Medir la longitud de trayectoria real (método de franjas de interferencia)
• Las ventanas de la celda deben estar limpias

Pastilla de KBr [1][3][4]:

• Usar un estándar interno para eliminar diferencias de espesor
• Usar el mismo lote de KBr para estándares y desconocidas
• Presión fija de la prensa de pastillas

ATR [3][7]:

• La presión neumática es mejor que la manual
• Misma presión cada vez
• Temperatura del cristal constante

8.2 Selección de la línea base

Línea base para altura de pico [3][4]:

• Seleccionar regiones 'sin absorción' a ambos lados del pico como puntos de la línea base
• La longitud de la línea base debe ser > 2 veces el ancho del pico
• Evitar seleccionar en el 'hombro' de picos adyacentes

Línea base para área de pico [3][4]:

• Seleccionar los límites de integración en los 'valles' a ambos lados del pico
• Evitar seleccionar en picos adyacentes
• Mismos límites de integración cada vez para la misma muestra

8.3 Selección de picos de análisis

Picos de análisis ideales [1][3][4]:

• Intensidad moderada (absorbancia 0.3–1.5)
• No superpuesto con otros picos
• Poco afectado por interacciones intermoleculares
• Fácil de asignar (ej. C=O, C-H, N-H)

Evitar seleccionar [1][3][4]:

• Picos superpuestos
• Cerca de picos de absorción fuerte (riesgo de flat-top)
• Picos de absorción débil (relación señal/ruido pobre)
• Regiones interferidas por agua/CO₂ (3400, 1640, 2350)

🔗 Extensión: Las características de los picos de análisis comunes (como C=O cerca de 1700) se encuentran en la página del grupo carbonilo en ftir.fun.

8.4 Consistencia en el tratamiento de estándares y muestras

Principios clave [1][3][4]:

• Mismo disolvente, misma matriz
• Mismo método de preparación de muestras
• Mismas condiciones de medición
• Mismo flujo de procesamiento de datos

Ejemplo [3][4]:

• Estándares en pastilla de KBr → las muestras desconocidas deben estar en pastilla de KBr
• Estándares con celda de CaF₂ → las muestras desconocidas deben usar celda de CaF₂

8.5 Experimentos paralelos

Número mínimo de réplicas [3][4]:

• Análisis general: 3 veces
• Análisis cuantitativo: ≥ 3 veces (RSD < 2%)
• Cuantificación farmacopea: 6 veces

Requisitos de RSD [3][4][6]:

• Cuantificación farmacopea: RSD < 2%
• Análisis industrial: RSD < 5%
• Análisis de investigación: RSD < 1%

Nueve. Ejemplo: Determinación del contenido de un componente en una mezcla

Demostremos el flujo de trabajo del análisis cuantitativo por infrarrojo con un ejemplo completo.

9.1 Tarea

Objetivo: Determinar el contenido de acetona en una mezcla industrial de acetona-etanol (se sabe que es aproximadamente 20–50%)

Muestras: 3 mezclas desconocidas (identificadas como M1, M2, M3)

9.2 Selección del método

Método: Transmisión con celda de líquido

• Muestra líquida → celda de transmisión (ver Ep 16)
• Se requiere cuantificación precisa → transmisión es mejor que ATR
• Hay estándares adecuados → método de curva de calibración

Selección de la longitud de trayectoria [3][4]:

• Acetona C=O (1715 cm⁻¹), $\varepsilon \approx 500$ L·mol⁻¹·cm⁻¹
• Rango de concentración: 20–50% ≈ 3–8 mol/L
• Paso óptico recomendado: $b = 1/(\varepsilon \cdot c) = 1/(500 \times 5) = 0.0004$ cm = 4 μm

Selección real: Celda de CaF₂ de 6 μm (evitar demasiado corto, facilitar manipulación)

9.3 Preparación de estándares

Preparar 5 soluciones estándar [3][4]:

• S1: 10% acetona + 90% etanol
• S2: 20% acetona + 80% etanol
• S3: 30% acetona + 70% etanol
• S4: 40% acetona + 60% etanol
• S5: 50% acetona + 50% etanol

9.4 Adquisición de espectros

Instrumento: Bruker Tensor II
Accesorio: Celda de CaF₂, paso óptico 6 μm
Parámetros: Resolución 4 cm⁻¹, 32 escaneos, 4000–400 cm⁻¹

Medición [3][4]:

1. Usar etanol puro como fondo (eliminar interferencia del etanol)
2. Medir espectros S1–S5
3. Medir espectros M1–M3

9.5 Procesamiento de datos

Pico de análisis: 1715 cm⁻¹ (estiramiento C=O de acetona) [1][5]

🔗 Extensión: Los picos característicos de la acetona y otros compuestos carbonílicos se encuentran en página de grupos carbonilo de ftir.fun.

Cálculo del área del pico [3][4]:

• Rango de integración: 1740–1690 cm⁻¹
• Línea base: conectar los puntos 1740 y 1690
• El software (OMNIC/OPUS) calcula automáticamente

Resultados [3][4]:

9.6 Curva de calibración

Ajuste lineal [3][4]:

$$A = 0.2065 \cdot c + 0.005$$

Parámetros lineales:

• Pendiente $k = 0.2065$ (área/%)
• Intersección $a = 0.005$ (cerca de 0, como se esperaba)
• Coeficiente de correlación $R^2 = 0.9998$
• Rango lineal: 10–50%

Área del pico
   ↑
12│                                ● S5
  │
10│                            ● S4
  │
 8│                        ●
  │
 6│                    ● S3
  │
 4│                ● S2
  │
 2│            ● S1
  │
 0│─────────────────────────────→ c (%)
   0   10  20  30  40  50

Figura 5: Curva de calibración de la acetona

9.7 Determinación de muestras desconocidas

Medir espectros de M1, M2, M3 [3][4]:

• Área del pico de M1: 5.20
• Área del pico de M2: 7.85
• Área del pico de M3: 3.50

Sustituir en la curva de calibración [3][4]:

• M1: $c = (5.20 - 0.005) / 0.2065 = 25.2\%$
• M2: $c = (7.85 - 0.005) / 0.2065 = 38.0\%$
• M3: $c = (3.50 - 0.005) / 0.2065 = 16.9\%$

9.8 Experimentos paralelos y precisión

Tres réplicas de M1 [3][4]:

• 1ª: 25.2%
• 2ª: 24.8%
• 3ª: 25.5%
• Promedio: 25.2%
• RSD: 1.4% (cumple con el requisito de farmacopea < 2%)

9.9 Informe

Informe de análisis cuantitativo
=================================

Muestra: M1 (mezcla acetona-etanol)
Método: Transmisión en celda líquida (CaF₂, paso óptico 6 μm)
Pico de análisis: 1715 cm⁻¹ (C=O de acetona)
Curva de calibración: A = 0.2065·c + 0.005
                     R² = 0.9998
                     Rango lineal 10–50%

Resultados:
  Contenido de acetona = 25.2% (p/p)
  RSD = 1.4% (n=3)

Operador: Zhang San
Fecha: 2026-07-24

10. Cuantificación por infrarrojo vs UV-Vis y cromatografía

10.1 Ventajas de la cuantificación por infrarrojo

① Sin necesidad de separación [1][4]

• Medición directa de mezclas
• No destruye la muestra
• Adecuado para análisis de procesos

② Proporciona información química [1][4]

• No solo cuantifica, también identifica
• Puede detectar cambios en grupos funcionales
• Adecuado para monitoreo de reacciones

③ Amplio rango de aplicaciones [1][4]

• Gases, líquidos y sólidos
• Orgánicos e inorgánicos
• Soluciones acuosas y no acuosas

④ Velocidad [1][4]

• Medición única en 1 minuto (ATR)
• Adecuado para alto rendimiento

10.2 Desventajas de la cuantificación por infrarrojo

① Baja sensibilidad [1][4][5]

• $\varepsilon$ es 10–1000 veces menor que UV-Vis
• Límite de detección generalmente > 0.1%
• No apto para análisis de trazas (por debajo de ppm)

② Control del paso óptico [1][4]

• Difícil control en pastillas de KBr
• El paso óptico en ATR varía con la longitud de onda
• Afecta la precisión cuantitativa

③ Interferencia por superposición [1][4]

• Superposición de espectros en mezclas complejas
• Requiere métodos quimiométricos

④ Preparación de muestras [1][4]

• Más compleja que UV-Vis
• Pastillas de KBr requieren habilidad
• Las celdas líquidas requieren limpieza

10.3 Comparación con UV-Vis

Tabla 4: Comparación cuantitativa IR vs UV-Vis (compilado de [1][4][5])

10.4 Comparación con cromatografía

Tabla 5: Comparación cuantitativa IR vs cromatografía (compilado de [1][4])

10.5 ¿Cuándo elegir cuantificación por infrarrojo?

Escenarios adecuados [1][4]:

• Concentraciones relativamente altas (> 0.1%)
• Mediciones rápidas (control de procesos)
• Sin destrucción de la muestra
• Necesidad simultánea de información cuantitativa y cualitativa
• Monitoreo de reacciones, análisis in situ

Escenarios no adecuados [1][4]:

• Análisis de trazas (< 0.1%)
• Mezclas complejas (> 5 componentes)
• Requisitos de alta precisión (< 0.5% RSD)
• Compuestos sin picos característicos

11. Buenas prácticas en análisis cuantitativo

11.1 Flujo de desarrollo del método

1. Análisis de requisitos
   │ Rango de concentración, precisión requerida, tipo de muestra
   │
   ▼
2. Selección del método
   │ Transmisión vs ATR; celda líquida vs pastilla
   │
   ▼
3. Selección del paso óptico
   │ Basado en ε y concentración
   │
   ▼
4. Selección del pico de análisis
   │ Intensidad moderada, sin superposición
   │
   ▼
5. Preparación de estándares
   │ 5–7 concentraciones, cubriendo el rango
   │
   ▼
6. Curva de calibración
   │ Medición, ajuste lineal, evaluación

1. Validación
   │ Exactitud, precisión, LOD, LOQ
   │
   ▼
2. Medición de muestras
   │ Réplicas ≥ 3
   │
   ▼
3. Informe
   │ Incluye descripción completa del método
   ```

Figura 6: Flujo de desarrollo del método de análisis cuantitativo (compilado de [1][3][4])

11.2 Indicadores de validación

Validación farmacopeica [6]:

• Exactitud: Recuperación de adición 98–102%
• Precisión: RSD < 2% (n=6)
• Linealidad: $R^2 > 0.999$
• Rango: 80–120% de la concentración objetivo
• Límite de detección LOD: Relación señal/ruido 3:1
• Límite de cuantificación LOQ: Relación señal/ruido 10:1
• Robustez: Pequeños cambios en parámetros no afectan el resultado

11.3 Análisis de fuentes de error

Tabla 6: Fuentes de error en análisis cuantitativo (compilado de [1][3][4])

Ilustraciones (clave en esta sección)

📷 Figura 7: Procesamiento de espectros
Fuente: ftir.fun diagrama educativo (con marca de agua; no es espectro real, solo para entender conceptos)

📷 Figura 8: Concepto de búsqueda en biblioteca
Fuente: ftir.fun diagrama educativo (con marca de agua; no es espectro real, solo para entender conceptos)

📷 Figura 9: Esquema de cuantificación de Beer-Lambert
Fuente: ftir.fun diagrama educativo (con marca de agua; no es espectro real, solo para entender conceptos)

Resumen de esta sección

Preguntas de reflexión

1. La ley de Beer-Lambert $A = \varepsilon bc$ falla bajo ciertas condiciones. Enumere al menos 3 causas comunes y explique cómo detectarlas y evitarlas.

2. Necesita determinar el contenido de un fármaco en una pastilla de KBr (aproximadamente 50%). Diseñe un esquema cuantitativo completo, incluida la selección del estándar interno, preparación de estándares, establecimiento de curva de calibración, medición de muestras desconocidas y precisión esperada.

3. Cuantifique el contenido de acetona en una mezcla de acetona-etanol mediante IR. Se sabe que $\varepsilon_{1715}$ de acetona = 500 L·mol⁻¹·cm⁻¹ y la concentración esperada es 30% (aproximadamente 4 mol/L). Calcule el espesor de celda recomendado. ¿Qué sucede si se usa una celda de 0.1 mm?

4. El RSD en cuantificación por IR suele ser 1–5%, mientras que en HPLC puede ser 0.5%. ¿Por qué la precisión en IR es menor que en cromatografía? ¿Qué fuentes de error son específicas de IR?

5. Necesita monitorear in situ una reacción de esterificación (ácido + alcohol → éster + agua) para rastrear la formación del éster. Diseñe un esquema cuantitativo por IR, explique si elige ATR o transmisión, qué picos usar para rastrear la reacción y cómo establecer una curva de calibración.

Referencias

[1] Griffiths P R, de Haseth J A. Fourier Transform Infrared Spectrometry. 2nd ed. Wiley, 2007. Chapter 11–13. ISBN: 978-0-471-19404-0.

[2] Beer A. "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten." Annalen der Physik und Chemie, 1852, 162(5): 78–88. DOI:10.1002/andp.18521620505.

[3] Smith B C. Quantitative Spectroscopy: Theory and Practice. Elsevier, 2002. ISBN: 978-0444511246.

[4] Smith B C. Fundamentals of Fourier Transform Infrared Spectroscopy. 2nd ed. CRC Press, 2011. Chapter 8–10. ISBN: 978-1420069297.

[5] Socrates G. Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies. 3rd ed. Wiley, 2001. ISBN: 978-0470093078.

[6] Comisión de Farmacopea de la República Popular China. Farmacopea de la República Popular China 2020 edición, Parte IV, Regla general 0402 Espectrofotometría infrarroja. Prensa de Ciencia y Tecnología Médica de China.

[7] Kazarian S G, Ewing A V. "Applications of FTIR Spectroscopic Imaging to Tablet Dissolution and Drug Release." Expert Opinion on Drug Delivery, 2013, 10(9): 1207–1221. DOI:10.1517/17425247.2013.802832.

[8] Wold S, Sjöström M, Eriksson L. "PLS-Regression: A Basic Tool of Chemometrics." Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2001, 58(2): 109–130. DOI:10.1016/S0169-7439(01)00155-1.

[9] ASTM E168-16. "Standard Practices for General Techniques of Infrared Quantitative Analysis." ASTM International, 2016.

[10] USP General Chapter <851>. "Spectrophotometry and Light-Scattering." United States Pharmacopeia.

[11] ICH Q2(R1). "Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology." International Conference on Harmonisation, 2005.

[12] ftir.fun. "Base de datos de grupos funcionales de espectroscopia infrarroja: carbonilo."
https://ftir.fun/ir/group/car…

Avance del próximo episodio: Ep 21 — Entrando en la tercera parte de nivel intermedio, se centrará en casos de aplicación de la espectroscopia infrarroja en industrias específicas
Este episodio es el cierre de la segunda parte "nivel básico". Desde Ep 1 hasta Ep 20, hemos completado el viaje desde los principios de la luz infrarroja, vibraciones moleculares, identificación de grupos funcionales, principios del instrumento, técnicas de muestreo, métodos de preparación de muestras, procedimientos operativos, procesamiento de espectros, análisis cualitativo hasta análisis cuantitativo. A partir del próximo episodio entraremos en la "parte intermedia", combinando casos reales de las industrias farmacéutica, alimentaria, de polímeros, ambiental, forense, entre otras, para profundizar las capacidades prácticas de la espectroscopia infrarroja.

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